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细胞外有一个奇怪的“石榴” 这就是科学家们取得新发现的方式

当很多有重大发现的科学家回忆当年的情况时，他们会说“我偶然发现了……”可能是一种异常现象，可能是一串异常数据，也可能是一件从未见过的怪事。然后根据课本或者史书上的记载，自然有了很大的发现，仿佛真理不过是散落在草丛里闪闪发光的宝石，运气好的话，弯腰捡起来就能发大财。

当然，事实并非如此。实验中的各种异常很容易被忽略为噪声，被筛选为误差，被排除为极值。敢于去冒险发现异常背后的故事需要勇气和远见。在这次探险中，科学家们是如何掌握线索的，如果他们沿着线索走，他们是如何检索到这些罕见但至关重要的文件的？他们是如何全方位思考的，他们是如何找到自己研究的切入点的，他们是如何发现自己走了哪一步的？今天的文章讲述了清华大学李煜发现和研究迁移体的故事，希望能给大家带来一些启发。

作者|李煜(膜生物学国家重点实验室)

我还记得那是2012年的一天。当时我正在检查前一天透射电镜拍的图像。一些不寻常的事情引起了我的注意。它是细胞外的一个囊泡，里面充满了许多较小的囊泡，看起来像一个开放的石榴。回过头来看，我以前也见过类似的结构，但这个图像的独特之处在于，很多小泡都集中在细胞外，有的内部是空的，有的有几个小泡，有的全是小泡。这张电子显微照片促使我开始思考这些结构是什么。死亡细胞的碎片？太整齐了。是外来体吗？太大了。是脱落的泡沫吗？有可能，但是囊泡里面是什么？很快，大家就把这种囊泡石榴样结构称为(PLS)。从这张电镜图片出发，我们开始了石榴的研究之旅。

为了鉴定石榴的标记蛋白，我们首先采用亚细胞分离的方法对石榴进行分离，然后通过质谱和绿色荧光蛋白(GFP)标记的方法对石榴中富集的多种蛋白进行鉴定。四跨膜蛋白4 (Tspan4)在偏最小二乘法中含量丰富，可作为一种良好的标记蛋白。但真正让我们吃惊的是，Tspan4还标记了一个连接在细胞末端的膜管网络，石榴体位于这些膜管的分叉点或末端。它的整体外观就像一个集成电路(图1)。在快速搜索文献后，我们发现这些膜管是回缩纤维，最早发现于1963年(Taylor和Robbins，1963)。然而，偏最小二乘结构在文献中还没有报道。利用绿色荧光蛋白标记的Tspan4，我们实时拍摄了石榴体的形成过程，很快发现与细胞迁移有关。当细胞迁移时，收缩细丝被拉出，石榴在收缩细丝的末端或连接处开始生长。随着细胞的不断迁移，收缩丝断裂，石榴体与细胞分离。由于石榴的形成依赖于细胞迁移，我们正式将石榴命名为migrasome(马等，2015)。

图1:1:L929细胞中的迁移子。刻度，20微米。

发现迁移器后，最重要的问题是迁移器有什么功能。当时我们还不能真正回答这个问题，甚至不能确定移民是否存在于体内。所以我们暂时绕过这个问题，研究移民能做什么。它们是用来释放细胞质蛋白等细胞内容物的吗？事实上，我们发现mCherry(一种红色荧光蛋白)可以被运输到迁移体，然后通过迁移体从细胞中释放出来。我们称这个过程为迁移性胞吐。迁移者能介导细胞间通讯吗？我们发现一个细胞产生的迁移体可以被另一个细胞吞噬，这表明迁移体至少可能参与细胞间细胞内物质的转移，从而可能介导细胞间的通讯。虽然这些概念证明实验不能告诉我们迁移者的功能是什么，但这些结果使我们提出了一系列假设来指导下一步的研究工作。

这些假设是：

1)迁移体在免疫细胞、转移性肿瘤细胞、发育细胞等迁移细胞中产生。2)迁移者受确定的遗传途径调节；3)迁移者可以介导细胞间的通讯。

在过去的几年里，我们为理解移民所做的探索性工作主要是以上述假设为指导，其中一些假设目前已经得到证实。

除了假设，我们还需要一个研究策略。为了回答这个问题(这可能是最重要的问题)，我们需要建立一个体内模型来研究移民。有了这个模型，我们就可以制造出具有移民缺陷的动物，找出这些动物身上存在的问题，进而了解移民的生理功能。当然，在此之前，我们首先要知道哪些基因是移民形成所必需的。因此，我们将重点研究移民的遗传途径，构建移民体内模型。除了这两个目标，我们还需要开发研究移民的工具，特别是检测移民的方法和探针。

知道知识吗

现在我们只需要使用GFP标记的迁移标记物，比如PH-GFP，在显微镜下就可以很容易的检测到迁移。此外，我们发现小麦精子蛋白WGA可以很好地染色移民。基于这一发现，我们开发了一种非常方便的方法来检测使用WGA的移民。

当迁移体形成时，拉伸丝从迁移细胞的轨道边缘被拉出，这意味着拉伸丝必须粘附在细胞外基质上。由于整合素是粘附在细胞外基质上的主要分子，并且我们的质谱结果也表明整合素在迁移中富集，所以我们重点关注整合素。研究表明，在迁移形成之前，活性整合素已经聚集在收缩丝的末端，活性整合素复合物与细胞外基质相互作用，沿收缩丝建立多个粘附位点，这些位点随后成为迁移形成位点(吴等人，2017)。

目前，迁移机制的研究进展大多源于我们对迁移形成过程的细胞生物学研究。在第四代移民被确定为移民标志后不久，我们还注意到第四代移民似乎促进了移民的形成。Tspan4属于四跨膜蛋白家族，有33个成员蛋白。我们发现，这些成员蛋白中有14种在过度表达时可以促进迁移体的形成(黄等，2019)。四种跨膜蛋白都有四个跨膜结构域，可以形成所谓的富含四种跨膜蛋白的微结构域(TEM)(Rubinstein，2011)。TEM大小约100 nm，富含胆固醇等一系列蛋白质和脂质瓣。我们发现在迁移过程中，许多小的TEM聚集形成微米级的大结构域，我们称之为四跨膜蛋白富集的大结构域(TEMAs)。有趣的是，我们发现TEMA的形成与收缩细丝上迁移体的生长有关。这表明TEMA的形成可能促进收缩丝的膜变形，形成迁移体。但是我们如何检验这个想法呢？

实验的关键进展源于一个意想不到的发现。在项目开始时，我们计划使用体外系统来研究Tspan4在膜上的行为。因此，我们需要将Tspan4-GFP引入巨型单层脂质体(guv)中，观察Tspan4-GFP在膜上的行为。因此，我们首先将Tspan4整合到蛋白质脂质体中，然后通过冲击融合蛋白脂质体制备GUV。结果令人惊讶。在Tspan4-GFP蛋白脂质体的电击融合过程中，我们观察到一些珠状结构，它们与迁移体和收缩丝的结构惊人地相似。而对照组蛋白质脂质体的融合过程中没有出现这种结构。这一发现表明，Tspan4本身可能足以驱动移民的形成。然而，由于我们不知道电击融合过程中到底发生了什么，我们决定设计一个体外系统来模拟迁移过程。

指导我们设计体外系统的关键启示是，我们认识到迁移细胞产生的拉力是迁移的关键因素。因此，我们设计了两种不同的方案将GUV引入膜管中，以模拟收缩丝的形成过程。在第一种方案中，我们将GUV贴在流体腔中，然后利用液体流动推动GUV，从而产生拉力。在第二个方案中，我们使用玻璃针从GUV中手动拉出膜管。这两个方案使我们能够成功地从包埋有Tspan4-GFP的GUV中拔出膜管。在拉管过程中，TEM聚集形成TEMA，在膜管上自发膨胀形成类似迁移的结构。

然而，为什么TEMA的聚集导致膜管膨胀成迁移体？科研最难受的就是做了一个完美的实验却无法解释结果。幸运的是，我认识特拉维夫大学的迈克尔科兹洛夫教授很多年了。他是一名具有物理学背景的生物物理学家，也是膜成型领域的顶级专家。迈克尔和他实验室里的一位聪明的研究生本祖克教授很快建立了一个从收缩丝到迁移的膜变形过程的数学模型。该模型表明，当结合的富含Tspan4的宏观域的弯曲刚度超过膜的其余部分时，收缩细丝将自发地膨胀以形成迁移体。这个模型可以用下面的类比来理解：假设我们有一根直径不变的橡皮筋，但是不同部位的弹性不同。当我们拉伸橡皮筋时，张力会使橡皮筋变长变窄，硬的部分比软的部分拉伸得少，所以会更厚。这个模型预测TEMA的硬度将比其他收缩丝的硬度大5-10倍。在随后的工作中，通过原子力显微镜直接测量迁移膜的硬度，证实了这一预测。因此，移民的形成是由一个简单的物理过程驱动的。

这个模型为我们理解移民的形成提供了一个理论框架。更重要的是，它决定了跨膜蛋白在移民形成中的中心位置，在此基础上，我们可以研究移民的生理功能。

在研究迁徙者和迁徙胞吐的生理功能时，最重要也是最困难的部分是建立合适的动物模型。当时，我们不知道迁徙会在什么时候、什么地方、什么样的动物身上出现。为了使搜索更加高效，我们制定了几个标准来衡量模型。首先，模型必须易于在显微镜下观察。其次，模型需要容易的遗传操作。最后，我们想要的型号应该是——，比较容易获得。如果隔壁实验室有，那就太好了。最后，我们决定尝试斑马鱼胚胎。斑马鱼胚胎透明，是显微研究的绝佳选择；而且基因敲除鱼很容易得到；最重要的是，以斑马鱼为模型的著名发育生物学家孟安明教授就在我们旁边的大楼里。

首先，我们构建了表达移民标记蛋白的斑马鱼胚胎，并利用活细胞成像技术对这些胚胎进行了观察。在第一个实验中，我们在活胚胎中观察到大量的迁移体和收缩丝(蒋等，2019)。我们发现迁移者主要是在前肠运动过程中形成的。我们已经知道迁移形成所必需的一系列基因，如itgb1b、tspan4a和tspan7。所以我们准备了这三个基因敲除的斑马鱼。我们发现在敲除鱼的胚胎中，迁徙者的数量减少了。更有意思的是，这些迁徙量减少的斑马鱼，器官形成都有缺陷。最明显的表型是不对称发育缺陷，包括左右翻转和各种器官的双侧复制。

但这是否意味着斑马鱼器官发生缺陷的消除是由迁移形成的减少引起的？

答案是：不一定。因为这些基因还有其他与迁移无关的功能，也有可能是那些功能调节器官的产生。这样，移民的形成完全有可能与器官形成无关。事实上，在很多领域，当我们研究一个特定的细胞内事件的生理功能时，都会遇到类似的问题，至今没有解决的办法。幸运的是，我们可以对迁徙者进行纯化，进行拯救实验——，将迁徙者从野生斑马鱼胚胎中纯化出来，然后注射到敲除鱼胚胎中。补充实验表明，被敲除的鱼胚胎在注射迁移体后成功恢复了器官形成，这表明器官形成确实依赖于迁移体，而不是与迁移体无关的Tspan4和Tspan7基因中的其他功能。

接下来的问题是，移民如何调控器官形成？我们推断，迁移者可能含有一些信号分子，这些信号分子将引导细胞在器官形成过程中做出正确的反应。为了验证这一理论，我们用定量质谱分析了纯化的移民。我们发现一些配体分子，如趋化因子、细胞因子、形态因子、生长因子等，确实在迁移中得到富集。其中，我们特别关注趋化因子CXCL12，因为CXCL12a敲除鱼具有类似于洄游鱼的不对称发育缺陷。此外，将野生斑马鱼胚胎移植物注射到CXCL12a敲除斑马鱼胚胎中，可以成功修复不对称发育的缺陷。因此，我们认为CXCL12是调节移民不对称发育的关键分子。

在斑马鱼胚胎中，有一个纤毛器官叫做库普弗囊泡(KV)，可导致其他器官左右不对称发育。我们发现迁移是KV形成的必要条件：KV在有迁移缺陷的胚胎中不能有效形成。KV是由一组迁移的前体细胞发展而来的，称为背侧前体细胞(DFCs)。在有迁移缺陷的胚胎中，树突状细胞在迁移过程中逃跑，无法到达目的地。这表明了一种可能性，即作为一种区域性趋化信号，迁移的树突状细胞可以被引导到胚胎的正确位置。为了验证这一假设，我们从野生型胚胎中纯化出迁移体，将其包埋在琼脂糖珠中，然后将这些珠插入胚胎的腹部(正常情况下，腹部不会出现DFCs)。我们发现含有迁移剂的珠子可以将树突状细胞吸引到腹部。因此，证实了迁移剂是树突状细胞的趋化信号。

现在，拼图的最后一块仍未完成。如果迁移子是树突状细胞的趋化信号，那么它们一定富集在树突状细胞迁移路径的末端区域。目前已证实胚胎盾(即脊椎动物早期胚胎发育中不透明的盾状结构)中会富集DFCs所以我们检查了胚胎护罩周围的区域。令我们惊讶的是，我们在胚盾下发现了一个很大的空腔，叫做“胚盾腔”。迁徙者在这个洞穴中高度富集。当我们给斑马鱼胚胎注射纯化的移民时，他们最终会留在胚胎盾腔内。这也可以解释为什么我们的补救实验成功了。

上述工作确立了移民第一个已知的生理功能，更重要的是，它为研究移民如何在其他生活过程中发挥作用提供了一个例子。在这个例子中，信号分子被包装到迁移体中，然后由迁移体在指定的位置释放，从而激活周围的细胞。从这个意义上说，迁移者可以整合空间、时间和特定的化学信息，这对于协调胚胎发育等复杂生命过程中的细胞群行为是不可或缺的。简而言之，移民是一个带有邮寄地址的信息包。

图2:迁移器的功能。

有待解决的已知未知问题

从我们的研究来看，仍然有许多明显的问题需要回答。总结如下，分享我的一些想法。

1)移民的生物发生机制是什么？

目前，除了我们鉴定的少数分子外，控制移民形成的信号通路尚不清楚。甚至，我们还不了解移民的很多基本特征。比如迁移体内的囊泡是什么？这些小泡是如何进入迁移体的？它们的作用是什么？

2)移民横向转移有什么生理功能吗？

我们知道，移民可以被周围的细胞吞噬，这可能是细胞间物质转移的机制。最近，我们发现一些种类的基因选择性地富集在迁移体中。当迁移体被周围细胞吞噬时，迁移体中的mRNA会在吞噬迁移体的细胞中被翻译成蛋白质，改变细胞的行为(朱等，细胞研究，已接受)。目前我们还不知道除了mRNA和蛋白质以外，还有哪些物质可以被移民转移，也不知道这种细胞间物质转移是否发生在体内，是否具有生理功能。

3)除了胚胎发育，移民还在哪些生物过程中发挥重要作用？

许多免疫细胞在发育和免疫反应过程中迁移，并分泌大量信号分子。听起来像是迁徙的身体可以展示才华的场景。

4)迁移是否具有细胞自主功能？

细胞可以利用移民吐出不需要的物质吗？这可以保持其自身的稳定状态，丢弃受损或有害的细胞成分，并保持表面分子的最佳水平.

5)移民的进化起源是什么？

它们来源于进化早期的单细胞生物，还是在多细胞生物出现后才出现？使用动物界内早期分支的模式生物系统，或许能够帮助我们回答这个有意思的问题。

未知的未知未知的未知

科学史提醒我们，在我们能想到的待解之谜外，总有"未知的"未知——凭我们现有的知识，根本无法预料将来还会遇到哪些问题。面对这些未知的未知，我们必须承认，大自然总是比我们想的更复杂。我们要有一颗敢于不断挑战已有模式的心，也需要有一双锐利的眼睛，能挑出现有理论框架下无法解释的现象。怀着这样的心态，或许再加上点好运，我们终将开启满是未知却新奇的世界。

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